通过体外转录（IVT）获得的mRNA反应混合物中，除了期望的mRNA产物外，还包含多种杂质，例如T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、NTP、模板DNA及其他添加剂，以及在IVT过程中产生的副产物（如dsRNA、截断RNA片段）。这些杂质可能对mRNA的功能产生负面影响，例如影响其定量准确性、降低翻译效率或改变免疫原性。因此，有必要通过纯化技术将目标mRNA从混合物中分离，以确保其纯度和完整性，从而保障产品的安全性和有效性。

常见的mRNA纯化方法包括：氯化锂沉淀、硫酸铵沉淀、磁珠纯化、硅胶柱膜纯化和层析纯化等。沉淀、磁珠和硅胶柱等方法操作相对简单且快速，但在处理规模和纯化效率上有限，因此多用于科研和早期研究。相比之下，在工业生产中，层析纯化是主要的方法。

硫酸铵沉淀法的研究进展

2024年1月，中科院过程工程研究所的张松平团队发表了题为“Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature”的文章，探索了硫酸铵沉淀法的可行性。这项研究集中于增强型绿色荧光蛋白（EGFP）编码的mRNA，发现当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%。但进一步提高硫酸铵浓度，沉淀速率变化不大。此外，溶解率也是一个重要指标，决定了mRNA的最终回收率。在室温下，硫酸铵浓度高于18M时，沉淀物能在3分钟内迅速溶解在无RNase水中，溶解率超过90%。最佳沉淀条件为2M硫酸铵（AS）、pH 7.0、温度20℃，沉淀时间2小时，能实现近100%的沉淀率和近100%的溶解率。

硫酸铵与LiCl沉淀法的比较

硫酸铵和氯化锂沉淀法在去除NTP的效率上均超过99%，而DNA模板的去除率约为82%和85%。尽管硫酸铵沉淀法在去除T7聚合酶方面不如LiCl，但其可以在室温下进行，使得工业生产中的应用更为便捷。

硅胶柱膜纯化

硅胶柱膜纯化基于硅胶膜表面的硅醇基团与mRNA之间的相互作用。在高盐环境中，阳离子桥的形成中和了mRNA与硅醇基团之间的电荷，促进了结合。而在低盐或水中，mRNA则被释放。此法对蛋白质和其他杂质的吸附基本不敏感，因此能有效分离mRNA与杂质，且相关材料安全无毒，环保理念符合实验室实践。

层析法的应用

在工业级纯化中，层析法已成为主流，以获得更高的核酸质量。Oligo(dT)亲和色谱是现代mRNA纯化的主要方法之一，由于其无法区分带Poly(A)尾的ssRNA与dsRNA等杂质，通常与疏水层析、阴离子层析联用，以提供更纯净的mRNA。这些方法在适应不同规模生产的同时，确保了产品的质量。

酶法的创新

在目前的工业流程中，通常采用蛋白酶K进行有效的杂质去除。蛋白酶K作为一种高效的丝氨酸蛋白酶，能够去除与核酸结合的蛋白质杂质。由于其分子量约为30KD，采用300KD孔径的TFF工艺能够有效去除混合物中的杂质，相比传统工艺在时间和成本上都更具优势。然而，蛋白酶K本身的免疫原性需要在实际应用中进行控制，以确保mRNA疫苗的安全性和有效性。

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